다색상촬영을 위한 직교형 형광화학유전자 리포터

형광 영상 기술은 세포 내 환경이 혼잡함에도 불구하고 라벨이 붙은 생체 분자의 국소화와 활동을 따라갈 수 있게 한다. 형광 라벨은 전적으로 합성(예: 유기 불소자, 양자점) 일 수 있으며, 유전적으로 완전히 암호화(예: 형광 단백질)되거나 혼합된 조합일 수 있다. 합성 라벨은 매우 밝고 광도가 높을 수 있지만, 높은 특수성을 가진 주어진 생체 분자를 목표로 하는 것은 종종 어렵다. 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 유전적으로 인코딩 된 형광 라벨은 사실상 모든 관심 단백질을 가진 유전적 융합을 쉽게 생성할 수 있게 해 주기 때문에 생물학자들에게 없어서는 안 될 도구가 되었다. 그러나 느린(분에서 시간) 산소 의존성 성숙에 시달린다.

대안으로, 합성 라벨의 장점과 유전자 인코딩 태그의 표적 특수성을 결합하는 방법으로 하이브리드 또는 화학 유전 시스템이 제안되었다. 또한 화학 유전학 시스템은 불소 포어의 색을 실험 조건에 적응시키는 능력을 통해 많은 실험적 다재 다능성을 제공하는데, 단순히 다른 세포가 투과 가능하고 살아있는 세포 호환 분자를 선택함으로써 가능하다.

화학 유전 체계는 일반적으로 단백질과 불소 포어 사이의 상호작용의 성질에 의해 분류될 수 있다. Halo-, 3 SNAP-, 4 및 CLIP-tag5는 인지 리간드를 인식하고 공동 부착을 촉매 하는 자체 레이블링 태그입니다. 이와는 대조적으로, 플루오르 겐 활성화 단백질(FAP)은 형광 콤플렉스를 생성하기 위해 인지 불소 물질과 비균형적으로 상호작용한다. 많은 자체 라벨링 태그와는 반대로, 이러한 시스템의 형광성 특성은 불소 포어가 처음에는 형광이 아닌 상태에 있지만 결합 시 형광이 된다는 것을 의미한다. 무한 염료를 제거하기 위한 별도의 세척 단계는 필요하지 않으므로 동적 프로세스를 보다 쉽게 수행할 수 있습니다. 단일 FAP는 일반적으로 다양한 구조적으로 유사한 불소 성 물질을 결합하며, 불소 성 유도체를 만들어 색 다양성을 도입하는 간단한 방법을 제공한다. 다른 플루오르 겐을 가진 여러 연속 라벨링 단계는 동일한 스펙트럼 영역에서 방출되는 다른 플루오르 포어가 있는 경우에도 FAP 불평등의 구별을 가능하게 하는 것과 같은 다른 이점을 제공할 수 있다. 그러나 FAP 바인딩의 비 규칙적인 특성은 다중 색상 이미징을 심각하게 제한한다.

우리 연구소는 최근 일련의 4-hydroxybenzylidene rhodanine 유도체와 빠르고 역방향적으로 상호작용하는 14 kDa 단량체 단백질인 새로운 플루오르 겐 활성화 단백질 FAST(Fluorescence-Activating and 흡수 시프팅 태그)를 개발했다. FAST와 상호 작용하는 불소 성 물질은 모두 KDS를 마이크로몰라에서 서브미크몰라로 전환하고, 파생 모델에 따라 540 nm에서 600 nm로 형광을 발생시킵니다. 최근에 이 시스템을 확장하여 분할을 생성했습니다. 분자 상호 작용을 위한 지표로 쉽게 사용할 수 있는 분할 형광 리포터. 분할 FAST는 가역성과 연관성과 분리의 운동학으로 독특하다. 그것의 조상 FAST와 관련 단백질과 마찬가지로, 이 분할 시스템은 방출 파장을 실험적인 맥락에서 쉽게 적응시킬 수 있도록 하는 플루오르 겐 난잡도의 특성을 공유한다.

플루오르 겐 문란 성은 스펙트럼 유연성 측면에서 분명한 이점이 있지만, FAST 또는 분할을 사용하는 것도 매우 어렵게 만든다.  두 개 이상의 대상에 서로 다른 색상으로 레이블을 지정하므로 기본적으로 이러한 시스템만 기반으로 하는 기존의 다중 색상 이미징은 불가능합니다. 사실, 비균형 플루오르 겐 활성 단백질을 사용한 다색 라벨링은 더 넓은 리간드 인식 문제의 특별한 예를 제시한다. 공학적인 단백질은 리간드 화학 구조와 결합 모드의 유사성으로 인해 종종 여러 리간드를 무차별적으로 인식한다. 대조적으로, 많은 천연 단백질은 정교한 감응을 보인다.  호르몬 수용체 또는 순환 뉴클레오티드 결합 단백질과 같이 중요한 생물학적 결과를 가진 매우 관련 있는 분자에 대한 양성. 리간드 결합의 선택성의 기초가 되는 원리를 푸는 것은 기본 신호 프로세스에 대한 우리의 이해뿐만 아니라 약물 설계과 합성 생물학에도 중요하다.

여기서는 다색 이미징을 위한 직교, 색상 선택 FAST 변형의 개발을 제시한다. 결과 변형은 특정 플루오르 겐에 대한 선택성에서 직교 성을 나타내며, 그 결과 선택적 녹색 또는 주황색/빨간색 방출을 나타내는 레이블이 생성된다. 우리는 광자와 광자 흥분 형광 현미경, 초해상도 영상 및 형광 수명 영상 모두에 대한 우리 구조의 유용성을 입증한다. 우리는 또한 진핵 세포 배양과 제브라피시 모델 모두에서 2색 형광 현미경을 시연하는데, 제브라피시 개발 초기에 매우 짧은 세포 주기를 관찰할 수 있다.